TUJUAN PRAKTIKUM

Mengisoalsi sentawa kafein dari simplisia teh hitam (Camellia sinensis

DASAR TEORI

Di zaman dahulu, genus Camellia dibedakan menjadi beberapa spesies teh yaitu sinensis, assamica, irrawadiensis. Sejak tahun 1958 semua teh dikenal sebagai suatu spesies tunggal Camellia sinensis dengan beberapa varietas khusus, yaitu sinensis, assamica dan irrawadiensis. Menurut Graham HN (1984); Van Steenis CGGJ (1987) dan Tjitrosoepomo G (1989), tanaman teh Camellia sinensis O.K.Var.assamica (Mast) diklasifikasikan sebagai berikut :

Divisi                      : Spermatophyta (tumbuhan biji)

Sub divisi              : Angiospermae (tumbuhan biji terbuka)

Kelas                      : Dicotyledoneae (tumbuhan biji belah)

Sub Kelas              : Dialypetalae

Ordo (bangsa)    : Guttiferales (Clusiales)

Familia (suku)    : Camelliaceae (Theaceae)

Genus (marga)   : Camellia

Spesies (jenis)   : Camellia sinensis

Varietas              : Assamica

Teh Hitam (Black Tea, Theae Nigra Folium, Schwarzer Tee) di dapat dari hasil peragian daun muda Camellia sinensis (L). Teh berasal dari pegunungan sebelah tenggara asia, sekarang dibudidayakan di hampir semua negara di daerah lintang utara antara 30 dan  40. Tergantung dari asalnya teh hasil fermentasi mengandung kafein 1-5%(min 2% menurut Ph.Gall.8) disamping teobromina dan teofilina yang kandunganya sangat kecil. Tanin dan hasil reaksi berwarna gelap (flobafena) dapat mencapai 25% (Stahl, 1985)

Secara umum ada tiga jenis teh yaitu:

  1. Teh yang tidak terfermentasi (Teh Hijau dan teh Putih )

Teh putih terbuat dari tunas dan daun muda yang diuapkan atau dikeringkan untuk meninaktifkan enzim polifenol oksidase. Teh putih dapat mempertahankan katekin dengan konsentrasi tinggi yang terdapat pada daun teh segar. Teh hijau terbuat dari daun teh yang lebih tua daripada teh putih., dengan melayukan, menguapkan dan pengeringan.Walaupun Teh hijau juga kaya akan katekin, tetapi mempunyai profil katekin yang berbeda dengan teh putih ( Santana-Rios, 2001)

  1. Teh semifermentasi ( Teh Oolong)

Dalam preparasinya daun teh “ dirusak atau dimemarkan” untuk mengeluarkan enzim poliphenol oksidase pada daun. Teh oolong  difermentasi dengan waktu yang lebih singkat daripada teh hitam. Akibatnya, kandungan katekin, theaflavin, dan thearubigin mempunyai konsentrasi diantara teh tak terfermentasi dan teh terfementrasi sempurana (Balentine, 2000)

  1. Teh Fermentasi sempurna ( Teh Hitam )

Daun teh menjadi teh hitam akibat proses pengrusakan daun untuk memaksimalkan interaksi antara katekin dan polifenol oksidase. Saat katekin kontak dengan polifenol oksidase, katekin saling bergabung membentuk dimer dan polimer, yang dikenal dengan nama theaflavin dan thearubigins. Proses oksidasi ini dalam industri dikenal denga “fermentasi”. Teh Hitam ini mengalami fermentasai sempurna sebelum mengalami proses pengeringan, akibatnya kebanyakan teh hitam kaya akan theaflavin dan tearubigins, tetapi katekinnya rendah (Lakenbrink, 2000)

Senyawa bioaktif di dalam teh, diantaranya adalah;

1.  Flavonoid

Flavonol merupakan golongan senyawa flavonoid yang paling banyak pada teh. Monomer flavonol yang paling banyak dikenal adalah katekin. Jenis katekin yang terdapat dalam teh antara lain: epikatekin (EC), epigallocatechin (EGC), epikatekin gallat (ECG) dan epigallokatekin gallate (EGCG) ( Balentine, 2000)

2.  Kafein

Semua jenis teh mengandung kafein, kecuali teh yang mengalami proses dekafeinnasi. Di tunas dan daun muda teh terdapat kadar kafein lebih tinggi daripada daun yang tua (Lin YS, 2003).

Komposisi kafein dalam teh dan kopi (Astill,2001; McCusker,2003)
Tipe Teh

Caffeine (mg/liter)

Caffeine (mg/8 ounces)

Hijau

40-211

9-50
Hitam

177-303

42-72
Coffee, brewed

306-553

72-13

3. Fluor

Tumbuhan teh mengakumualasi fluoride di daun. Secara umum, daun teh yang tua mengandung fluoride lebih banyak (Wong, 2003). Brick Tea, teh kualitas yang rendah, yang terbuat dari daun teh yang tua, mengandung fluoride yang sangat tinggi.  Simptom dental fluorosis ditemukan pada anak-anak dan orang dewasa di Tibet yang mengkonsumsi Brick Tea (Fung, 1999)

Fluoride yang terkandung dalam teh ( Fung, 1999)
Tipe teh

Fluoride (mg/liter)*

Fluoride (mg/8 ounces)

Hijau

1.2-1.7

0.3-0.4
Oolong

0.6-1.0

0.1-0.2
Hitam

1.0-1.9

0.2-0.5
Brick tea

2.2-7.3

0.5-1.7

Dari investigasi proses manufaktur dari salah satu macam teh hitam menyatakan bahwa proses pembuatan teh hitam terdiri dari lima langkah yaitu; whithering, rolling, fermentation, drying, dan sorting (Lin D, 2004).

  1. Whithering.

Setelah daun teh dipanen, daun teh dilayukan dengan menghembuskan udara datasnya.

  1. Rolling

Proses penghancuran daun teh  dapat dilakukan dengan dua cara yaitu CTC ( Crush, Tear, Curl ) dan orthodox. Cara CTC dengan menggunakan mesin, cara ini efektif dan efisien serta dapat menghasilkan produk dengan kualitas tinggi, sedang rendah. Proses orthodox menggunakan mesin dan tangan (manual). Proses secara manual menghasilkan produk teh berkualitas tinggi.

  1. Fermentation

Daun ini mengalami oksidasi pada temperatur dan kelembapan yang terkontrol. Tingkat oksidasi dapat membedakan kualitas dari teh hitam. Waktu fermentasi sebenarnya sudah dimulai saat proses rolling. Jadi proses diantara rolling dan fermentasi ini sangat penting dalam menentukan kualitas teh

  1. Drying

Pengeringan ini bertujuan untuk menginaktifkan enzim polifenol oksidase sehingga proses oksidasi terhenti

  1. Sorting

Selanjutnya teh disortasi menurut ukuranya ( fragmen utuh, serpihan dan serbuk halus).  Sortasi dapat dilakukan dengan kriteria lain.

Setelah Proses Fermentasi ada perubahan komposisi dan senyawa yang terdapat di dalam teh diantaranya;

  1. Katekin oleh enzim polifenol oksidase mengalami oksidasi menjadi theaflavin dan thearubigin, yang berpengaruh pada aroma, rasa dan warna dari teh hitam ( Mahanta, 1985)
  2. Protein terdegradasi (Mahanta, 1985
  3. Kandungan kafein meningkat (Mahanta, 1985)
  4. Klorofil teroksidasi menjadi senyawa pheophytins (Mahanta, 1985)
  5. Dari hasil oksdasi ditemukan polimer dengan berat molekul tinggi yaitu dibenzotropolones, theadibenzotropolone A, B, C dan Tribenzotropolone, theatribenzotropolone.( Sang, 2004)
  6. Katekin dan metabolit quinon dari katekin menjadi produk yang minoritas ( Tanaka, 2005)
  7. Di dalam teh hitam terdapaat pigmen orange merah yaitu Dehydrotheasinensis dengan struktur1,2 diketon (Tanaka, 2005)
  8. Setelah proses fermentasi, konsentrasi 16 senyawa polisiklik aromatik hydrocarbon (PAHs) menjadi lebih tinggi .(Lin, 2004)

PEMBAHASAN

Tujuan dari praktikum ini adalah untuk menganalisis senyawa aktif atau senyawa mayor dari suatu tanaman . Dalam praktikum ini akan dilakukan isolasi kofein dari teh hitam .

Di  daun teh yang segar terdapat senyawa-senyawa seperti sellulosa, tannin, katekin, enzim polipenol oksidase,  kafein, flavonoid pigmen dan sedikit klorofil. Tetapi setelah mengalami fermentasi senyawa-senyawa tersebut dapat berubah struktur dan komposisinya.  Pada proses fermentasi katekin bereaksi dengan enzim polifenol oksidase menjadi Theaflavin dan Thearubigin yang merupakan mayor pigmen pada the hitam (Sang, 2004). Pada proses fermentasi, protein teregradasi dan klorofil diubah menjadi pheophytin ( PK Mahanta & M Hazarika, 1985). Pada teh fermentasi kandungan kafein meningkat ( PK Mahanta, 1988). Teh Hitam mngandung lebih banyak kafein yaitu 42-72 mg/8ons daripada pada teh hijau yaitu 9-50 mg/8ons ( Astill,2001 ; McCusker, 2003). Kandungan kafein pada the hitam lebih tinggi daripada teh oolong, teh hijau, dan teh segar, namun kandungan Epigllokatekin 3-gallat pada teh hitam terendah daripada the yang lain (Lin, 2003). Karena kafein terdapat dalam teh hitam, dengan komposisi yang banyak, maka akan dilakukan isolasi kafein pada praktikum ini.

Untuk mengisolasi kofein dari teh hitam , mula – mula 25 mg serbuk teh hitam ditempatkan dalam soxhlet extractor kemudian dilakukan ekstraksi dengan menggunakan pelarut etanol selama tiga jam . Prinsip dari ektraksi adalah menarik suatu senyawa tertentu kedalam pelarut yang sesuai . Alasan digunakan etanol sebagai pelarut karena etanol sebagai pelarut universal, sehingga dapat melarutkan kafein. Hal itu dikarenakan kafein larut dalam etanol dengan perbandingan 1:130 (Clarke, 1986). Selain itu, etanol dapat mengawaaktifkan enzim yang dapat menguraikan asam nukleat, sehingga keberadaan kafein tetap terjaga dalam ekstrak tersebut ( Robinson, 1991 ). Pada dasarnya senyawa induk purina tidak terdapat secara bebas di alam tetapi terikat dalam bentuk asam nukleat . Walaupun ada beberapa diantaranya yang terdapat bebas di alam , tapi hal ini diduga karena proses peruraian dari asam nukeat ataupun karena senyawa murni dari alam . (Robinson, 1991 ) Kofein merupakan purina xanthin sehingga ada kemungkinan kofein terdapat dalam bentuk asam nukleat ataupun dalam bentuk basa bebas ( akibat dari proses hidrolisis asam nukleat ). Oleh karena itu digunakan pelarut etanol yang tidakmerusak asam nukleat sehingga nantinya kofein yang dapat diisolasi lebih banyak . Digunaknan cara soxhletasi untuk melakukan ekstraksi karena soxhletasi mempunyai kelebihan diantaranya : waktu untuk mengekstraksi lebih cepat , ekstraksinya lebih sempurna karena digunakan penyariannya secara kontinyu, Dibutuhkan pelarut yang sedikit, senyawa yang disari lebih banyak. Prinsip dari soxhletasi adalah perendaman bahan yang ekstraksinya melalui pengaliran ulang larutan perkolat secara kontinyu sehingga bahan yang diekstraksi tetap terendam cairan, Akhirnya dengan alat tersebut juga dapat dilakukan ekstraksi melalui aliran bahan pelarut melintasi bahan yang akan diekstraksi secara kontinyu ( Voigt, 1995). Kelemahan dari soxhletasi adalah tidak cocok untuk bahan yang labil terhadap panas . Kofein mempunyai titik lebur Antara 235-237,5 ˚ C , sehingga kofein dapat dikatakan relatif stabil terhadap panas (Farmakope Indonesia Edisi III , 1995 ). Oleh Karena alasan tersebut digunakan cara soxhletasi untuk mengekstraksinya .

Ekstrak yang diperoleh kemudian diletakkan dalam cawan porselein yang telah berisi 12,5 magnesium oksida dalam 75 ml air , kemudian diuapkan hingga kering dengan penangas air . Penambahan magnesium oksida dilakukan dengan tujuan untuk menjerap kofein dalam ekstrak dan untuk menghilangkan senyawa tanin . ( Robinson, 1991 ) Hal tersebut karena tanin cenderung membentuk kompleks dengan kofein sehingga akan mempersulit tahap isolasi kofein. Dengan penambahan Magnesium oksida, tannin akan berikatan dengan Mg dan berubah menjadi bentuk garam, sehingga kafein terlepas dalam keadaan basa bebas. Penguapan dilakukan dengan tujuan untuk menghilangkan sisa air dan etanol karena kofein agak sukar larut dalam etanol .

Tahapan selanjutnya mendidihkan residu dengan menggunakan air mendidih sebanyak tiga kali ( 125ml ; 62,5ml ; 62,5ml ) kemudian disaring selagi panas dengan menggunakan corong buchner . Tujuan mendidihkan dengan menggunakan air adalah untuk mendesorpsi kofein yang muda ( Bentuk nukleosida ) karena bentuk nukleosida mempunyai kelarutan yang baik dalam air  ( Raphael ikan ) . Selain itu kelarutan kafein dalam air mendidih cukup besar yaitu dengan perbandingan 1:1 ( Clarke,1986 )

Bentuk suspensi akibat pemberian magnesium oksida disaring selagi panas dengan menggunakan corong buchner sehingga didapat larutan . Selanjutnya kedalam larutan tersebut ditambahkan 12 ml asam sulfat 10 %, lalu diuapkan hingga 1/3 volume awalnya . Tujuan dari penambahan asam sulfat ini adalah untuk mengendapkan sisa magnesium oksida dan untuk mendenaturasi asam nukleat sehingga dapat mencegah pembentukan ikatan kembali antara kofein dengan asam nukleat. (Robinson, 1991). Larutan tersebut kemudian disaring untuk menghilangkan endapan yang terbentuk akibat penambahan asam sulfat .

Langkah berikutnya adalah mengekstraksi dengan menggunakan 7,5 ml kloroform sebanyak tiga kali dalam corong pisah . Digunakannya kloroform karena kofein mudah larut dalam kloroform ( Farmakope Indonesia Edisi III , 1995 ). Kelarutan kafein dalam klorofom yaitu dengan perbandingan 1:7 ( Clarke,1986 ).  Kloroform bersifat non polar, jadi kafein cenderung terlarut dalam kloroform, sedangkan senyawa xantin lain seperti teofilin dan teobromin terlarut  dalam fase air, karena senyawa-senyawa tersebut cenderung bersifat lebih polar daripada kafein. Jadi perlakuan ini bertujuan untuk memisahkan kafein dari derivat xanthin lain.

Kemudian ditambahkan sedikit NaOH 1 % ke dalam ekstrak tersebut yang diikuti penggojongan secara perlahan . Penambahan NaOH berfungsi untuk menghilangkan warna kuning pucat dari ekstrak tersebut dan memberikan suasana basa sehingga kofein mudah larut dalam kloroform . Warna kuning tersebut disebabkan karena pigmen theaflavin dan thearubigin pada teh hitam. Penggojogan dilakukan secara perlahan karena penggojogan yang terlalu kuat akan menyebabkan terjadinya emulsi pada ekstrak . Adanya emulsi akan menyebabkan proses pemisahan yang kurang sempurna. Emulsi juga disebabkan oleh adanya sisa senyawa polifenol yang belum hilang, dengan penambahan NAOH, senyawa fenol menjadi fenolik anion dan membentuk garam, sehingga terjadi surfaktan anionik. Surfaktan tersebut yang menyebabkan emulsi. Hasil dari pemisahan tersebut akan terbentuk dua fase yaitu fase air ( lapisan atas ) dan fase kloroform ( lapisan bawah ). Kofein terdapat dalam fase kloroform .

Kemudian kloroform diuapkan sehingga akan terbentuk serbuk putih berbentuk jarum mengkilat dan menggumpal. Purifikasi senyawa kafein cukup dengan kristalisasi. Kafein dapat menyublim pada suhu 180°C ( Clarke,1986) Untuk mendapatkan kristal kofein yang mentah cukup dengan mengkristalkan kembali serbuk tersebut dengan sedikit air panas . Kristal yang terbentuk dalam percobaan kali ini adalah kristal putih agak kekuningan, seharusnya didapatkan kristal putih mengkilap. Hal ini disebabkan terbentuknya emulsi pada penambahn NaOH, Sehingga NaOH tidak optimal dalam menghilangkan warna kuning pcat pada ekstrak kloroform tersebut. Total kristal kofein yang berhasil diisolasi adalah 156,8 mg

Untuk mendeteksi kebenaran kofein yang didapat dilakukan murexide test dan uji spektrum kofein . Murexide test dilakukan dengan cara melarutkan cuplikan tersebut dalam tiga tetes HNO3  pekat kemudian diuapkan sampai kering dan ditambahkan dua tetes NH4OH , hasil dikatakan positif jika berwarna merah lembayung   ( harborne , 1996 ) . Hal tersebut tidak dilakukan karena tidak tersedianya NH4OH di laboratorium . Uji spektrum kofein dengan sinar uv pada panjang gelombang maksimum 278 nm akan memberikan serapan optimal pada panjang gelombang 260 nm . kofein oleh proses fermentasi akan mengalami oksidasi , senyawa hasil oksidasi kofein akan membentuk warna kuning . ( Stahl ,1970 ) Dasar reaksi inilah yang digunakan Bontemps untuk menetapkan kadar kofein secara spektrofotometri . Dalam praktikum ini uji spektra tidak dapat dilakukan karena spektrofotometri yang ada , kalibrasi alatnya sudah tidak sesuai lagi .

Pada praktikum ini untuk mendeteksi keberadaan kafein digunakan uji kromatografi lapis tipis ( KLT ).   Keuntungan dari sistem KLT antara lain : dengan jumlah zat yang sangat kecil dapat dipisahkan dengan jelas , hasil pemisahan lebih baik dengan batas deteksi lebih rendah , butuh waktu singkat dengan sedikit alat. Langkah untuk melakukan sistem ini cukup dengan menotolkan hasil yang didapat pada lempeng silica GF 254 , kemudian dielusi dengan fase gerak kloroform-etanol (99:1). Pada kromatogram jika dilihat dengan sinar uv pada λ 254 nm maka bercak kofein akan berpendar biru dengan harga Rf sekitar 0,55 – 0,65 (Stahl, 1970 ) . Hasil KLT pada ekstrak kloroform menunjukkan Rf sebesar 0,34, bercak kafein berpendar biru dan sejajar dengan kofein standar.

Pada praktikum ini juga dilakukan KLT preparatif pada ekstrak air, Didapatkan 2 bercak dengan garis memanjang. Bercak tersebut lalu dikerok dan dilarutkan dalam kloroform, lalu ditotolkan pada lempeng KLT silika gel GF 254 dan fase gerak kloroform-etanol (99:1).  Pada plate terdiri dari tiga totolan yaitu dari kiri pembanding, pita bercak paling bawah dan pita bercak paling atas. Didapatkan  Rf dari kiri 0,35; 0,39 ; 0,42. Bercak dengan Rf 0,35 adalah kafein pembanding, Bercak Rf 0,39 adalah senyawa lain (pengotor), dan Bercak dengan Rf 0,42 adalah kafein yang diisolasi dari teh hitam. Jadi dapat disebutkan pada ekstrak air, kafein masih bercampur dengan semnyawa lain dan, kafein benar-benar terpisah pada ekstrak kloroform.

KESIMPULAN

  1. Kafein dapat di isolasi dari Teh Hitam
  2. Cara ekstraksi yang digunakan adalah soxhletasi dengan etanol 96%
  3. Dalam 25 gram serbuk teh hitam, didapatkan kafein sebanyak 156,8 mg
  4. Purifikasi kafein dapat dilakukan dengan cara kristalisasi
  5. Identifikasi kafein dapat dilakukan dengan penampakan bercak di uv 254 yaitu berpendar biru dengan Rf 0,34

________________________________
*Dalam rangka mendokumentasikan Laporan Praktikum Analisis Kandungan Tumbuhan Obat, when I was study in Pharmacy Gadjah Mada University, with my parters : Victoria Dian K, n Agung Sofyan E,

Laporan tertanggal 14 Desember 2006, selesai pukul 11.47 PM
rencananya dikumpulin keesokanya, tapi karena lupa, pembuat laporan ini tidak membawanya… (fyuhh…padahal direwangi buat laporan sampe tengah malam) hehehe
*warna-warni anak kuliahan yang ditempa oleh siksaan praktikum (alahhh lebay :D)